עבודת גמר פיתוח מודל חדש לסרטן ריאות ראשוני המחקה את התפתחות המחלה בשלביה המוקדמים

Transcription

1 עבודת גמר פיתוח מודל חדש לסרטן ריאות ראשוני המחקה את התפתחות המחלה בשלביה המוקדמים Mimicking growth and metastasis of early-stage human lung cancer using a novel orthotopic animal model כמילוי חלק מהדרישות לשם קבלת תואר דוקטור לרפואה מטעם ביה"ס לרפואה של האוניברסיטה העברית והדסה, ירושלים. מוגש ע"י:עמרי דומינסקי ת.ז מסיים שנה ו' בשנה"ל תשע"ו )6002( בנימיני אהרון 4, ת"א Domi.omri@gmail.com שמות המדריכים: ד"ר אורי ולד,,M.D,Ph.D המכון לתרפיה גנטית ע"ש גולדין סאבד, המחלקה לכירורגית חזה ולב, בי"ח הדסה עין כרם, ירושלים. ד"ר עוזי יזהר,,M.D מנהל היחידה לכירורגית חזה, המחלקה לכירורגית חזה ולב, בי"ח הדסה עין כרם, ירושלים. מיקום ביצוע העבודה: המכון לתרפיה גנטית, בי"ח הדסה עין כרם. 1

2 חתימת המנחים: ד"ר אורי ולד M.D, Ph.D המחלקה לכירורגית לב וחזה בי"ח הדסה עיו כרם ד"ר עוזי יזהר M.D המחלקה לכירורגית לב וחזה מנהל היחידה לכירורגית חזה ב"יח הדסה עין כרם חתימת התלמיד עמרי דומינסקי -ת.ז

3 תודות תודה לד"ר עוזי יזהר, פרופ' אמנון פלד ופרופ' עוז שפירא. תודה לגברת חנה ולד אשר לימדה אותי טכניקות עבודה שונות ושימוש בכלים מעבדתיים. תודה לד"ר עידו וייס על הדרכתו המסורה. ולבסוף, תודה מיוחדת שמורה לד"ר אורי ולד, על ההנחיה והחניכה הצמודה לאורך המחקר בסבלנות ובאורך רוח ייחודית ויוצאת דופן. 3

4 תוכן עניינים תקציר...5 מבוא...7 מטרות העבודה חומרים ושיטות תוצאות דיון סיכום סיכום באנגלית רשימת ספרות נספח

5 תקציר מבוא: בשנים האחרונות חלו שיפורים רבים בדרכי הטיפול בסרטן הריאות )כימותרפיה, רדיותרפיה וסוגי ניתוחים שונים(. אולם, שיעור התמותה ממחלה זו נותר ברובו ללא שינוי, בעיקר בשל ההתפשטות המהירה של המחלה הן באופן מקומי והן לאתרים מרוחקים )גרורות(. סרטן הריאות הינו גורם המוות הנפוץ ביותר בקרב מחלות הסרטן הן בנשים והן בגברים, ותרומתו לתמותה גדולה יותר מאשר כל מקרי המוות הנגרמים מארבעת סוגי הסרטנים הכי נפוצים אחריו: סרטן השד, המעי הגס, הפרוסטטה והלבלב יחדיו. סך השרידות של חולי סרטן הריאות מגיע לכ 04% ל- 4 שנים. לכן, אסטרטגיות טיפוליות חדשות עבור חולים אלו נדרשות כמו אוויר לנשימה. מחקרים עדכניים מצביעים על קיומה רשת קשרים ענפה בין תאי הגידול של סרטן ריאות לבין המיקרו- סביבה של הריאה עצמה. קשרים אלה מעורבים בבקרה של היווצרות הגידול ובמאפייניו כגון גדילה, פולשנות ושליחת גרורות. ואולם, המחקר של תהליכים פתולוגים אלו מוגבל כיוון שלא קיים מודל בבעלי חיים, המדגים את מהלך המחלה בשלביה המוקדמים והתקדמותה, כפי שמתרחשת בבני אדם. כלומר, יצירת קשרית בודדת של גידול בריאה המוקפת בפרנכימה תקינה, גדלה ומתפשטת לאורך זמן. מטרות העבודה: פיתוח מודל חדשני בבעלי חיים המדגים את מהלך מחלת סרטן הריאות בשלביה המוקדמים והתקדמותה הפרוגרסיבית, כפי שמרחשת בבני אדם. דהיינו, יצירת מהלך מחלה המתפתח דרך קשרית גידול בודדת בריאה ועד למחלה פולשנית השולחת גרורות. מודל זה עשוי לשמש כפלטפורמה חדשנית ללימוד הקשרים בין תאי הגידול מטרות תרפויטיות חדשניות. למיקרו-סביבה של הריאה. דבר זה יאפשר בעתיד מציאת שיטות: בניגוד לשיטות קיימות, בעבודה זו הוזרקו כמויות מזעריות של תאי סרטן ריאות הן ממקור הומני והן ממקור עכברי, ישירות לפרנכימת הריאה השמאלית של עכברים. לאחר ההזרקה, בוצע מעקב PET\CT אחר התקדמות המחלה באמצעות הדמיות וכן באמצעות דיסקציות של החיות בזמנים שונים,GFP ממועד ההזרקה. בנוסף, נעשה שימוש בתאים סרטניים אשר הודבקו בפלסמיד המבטא מנת על לקבוע את הפיזור המיקרו-אנטומי של הגידול. תוצאות: קשרית ריאתית בודדת, מוקפת פרנכימת ריאה תקינה נוצרה בהצלחה במעל ל 00% מהעכברים. במשך זמן מעקב של 0-4 שבועות, הקשרית גדלה והתפשטה הן מקומית והן דיסטלית )גרורות(. בנוסף, 5

6 שימוש בתאים סרטנים המבטאים GFP הדגים את ייחודה של טכניקת ההזרקה הניתוחית וקיומו של אזור מיקוד בודד בריאה. מסקנות: בעבודה זו נוצר בהצלחה מודל, אשר מדמה את רצף האירועים הפתולוגי המאפיין את סרטן הריאות ההומני בשלביו הראשונים. מודל זה פותח צוהר לגישה חדשנית בחקר האינטראקציה שבין תאי הגידול לסטרומה שסביבם. יתר על כן, המודל מקנה אפשרויות חדשות בחיפוש אחר מטרות טיפוליות, המיודעות לסרטן ריאות בשלביו הראשונים. לפיכך, מודל זה מתעלה על המודלים הקיימים כיום המבוססים על השרייה גנטית, בכמויות נרחבות. טרנספורמציה אפיתליאלית והשתלה אקטופית של תאים ממאירים 6

7 מבוא סרטן הריאות הינו אחד מבין הגידולים הממאירים השכיחים והקטלניים ביותר בקרב גברים ונשים כאחד. 0 שיעור התחלואה מסרטן ריאה נמצא בעלייה מתמדת, כאשר סוג זה של סרטן הינו בעל שיעורי התמותה הגבוהים ביותר. ע"פ ארגון הבריאות העולמי, בשנת 6006 כ 60% )0.41 מיליון איש( מכלל מקרי המוות בעולם כתוצאה מסרטן נגרמו ע"י סרטן ריאות. 6 בארה"ב מאובחנים כ 006,000 מקרים חדשים בשנה, ובישראל מאובחנים כ חולים חדשים בשנה. למרבה הצער, גם חולים אשר נחשבים כבעלי פרוגנוזה טובה במיוחד IA-IIB( )stage לא מגיעים לאחוזי הישרדות של 40% ל- 4 שנים. 4 נגרמת בעקבות זו מחלה חלוקה בלתי מבוקרת ומהירה של תאי רקמת הריאה. תהליך הגדילה הבלתי מבוקרת יכול להוביל להתפשטות גרורות לאתרים מרוחקים. התפשטות המחלה מתרחשת בשלושה 4. התפשטות כיוונים אופייניים: 0. גדילה מקומית ופלישה לרקמות סמוכות. 6. חדירה לימפתית. המטולוגית. אתרי גרורות ידועים להתפשטות סרטן ריאות כוללים את המח, הכבד, בלוטות לימפה, בלוטת האדרנל והעצמות. כאשר המחלה מאובחנת בשלבים מאוחרים הפרוגנוזה גרועה במיוחד. לחולים במחלה זו סימפטומים מרובים ופגיעה ניכרת באיכות החיים. 3-2 לרוב, בשלבים ראשונים של המחלה לא קיימים סימפטומים אופייניים. אולם, ככל שהמחלה מתקדמת יותר ניתן לראות סימנים כמו: דלקות ריאה חוזרות, קוצר נשימה, שיעול כרוני, שיעול דמי, כאבים בחזה, אובדן תאבון ומשקל, עייפות וקשיים בבליעה. חלק מסרטני הריאה מתאפיינים באספקת דם עשירה אשר יכולה להוביל לדימום לתוך דרכי הנשימה ולגרום לשיעול דמי. הופעה מאוחרת זו של התסמינים, מובילה לך שמרבית החולים מאובחנים בשלבים מתקדמים. 2,0 אחד מגורמי הסיכון העיקריים במחלה זו הוא עישון. מדי שנה מתים כ 2 מיליון אנשים בעקבות חשיפה לעשן סיגריות. כ 4 מיליון מקרי מוות נגמרים בעקבות עישון אקטיבי, בעוד שבסביבות 200 אלף מקרים נגרמים מעישון פאסיבי. כל שש שניות מת אדם כתוצאה מעישון ברחבי העולם. עשן הסיגריות מכיל פקטורים קרצינוגנים רבים, דבר המעודד התפתחות גידולי ריאה באופן ישיר. 0 בנוסף לעשן סיגריות, לסרטן הריאות ישנו גורם גנטי. מחקרים שנעשו בתחום הראו כי לקרובי משפחה לא מעשנים מדרגה ראשונה של חולי סרטן ריאה יש סיכון מוגבר לפתח את המחלה. 1 7

8 סרטן הריאות מתחלק לשתי קבוצות עיקריות. חלוקה זו מתבססת על גודל וסיווג היסטופתולוגי. לחלוקה זו חשיבות רבה כיוון שקיימים הבדלים באופן הטיפול והפרוגנוזה בכל קבוצה. 00 שתי הקבוצות הן: SCLC.NSCLC Non small cell lung carcinoma ו- Small cell lung carcinoma מהוה כ 04% מכלל מקרי סרטן הריאה בארה"ב. ניתן לחלק קבוצה זו לשלוש תת קבוצות NSCLC. כאשר large cell lung carcinoma,adenocarcinoma עיקריות:,Squamos cell lung carcinoma אדנוקרצינומה מהוה 30% מכלל מקרי הNSCLC, והיא נמצאת בקורלציה לעישון, אך היא גם הסוג הנפוץ ביותר בקרב חולי סרטן אשר לא עישנו מעולם. 00,00 דירוג הסרטן מהווה מרכיב חשוב בפרוגנוזה ובדרכי הטיפול האפשריות. דירוג NSCLC נעשה ע"פ שיטת ה,TNM כלומר, גודל הגידול הראשוני, מעורבות קשרי לימפה והימצאותן של גרורות. שילוב שלושת. 06 מרכיבים אלו, משמש להגדרת דרגה כללית לגידול. NSCLC מדורג מדרגה IA )פרוגנוזה הטובה ביותר( ועד IV )הפרוגנוזה הגרועה ביותר( הטיפול בסרטן ריאות תלוי בסוג הקרצינומה, בדירוג ובמצבו הכללי של החולה. אפשריות הטיפול כוללות טיפול תומך, ניתוח, כימותרפיה ורדיותרפיה. 3,0 כיוון שלרוב הופעת הסימפטומים מתרחשת בשלבים מאוחרים של המחלה, רק כ 64% מחולי סרטן הריאות מאובחנים בשלבים מוקדמים של המחלה )דרגות )II,I. בחולי אלה ניתן לטפל בניתוח להסרה כירורגית של הגידול. חולים המאובחנים בשלבים מאוחרים יותר, מטופלים בכימותרפיה ורדיותרפיה. רוב חולים אלו אינם שורדים מעבר לחמש שנים. 00,04, הפרוגנוזה הכוללת בסרטן ריאות הינה עגומה מאוד ורק 04% מכלל החולים ישרדו מעבר ל 4 שנים בNSCLC הפרוגנוזה גרועה במיוחד. אמנם, לאחר הסרה כירורגית מלאה של הגידול בשלב IA השרידות ל 4,40% IB שנים עומדת על 20%. ובשלב שרידות זו עומדת על אך מרבים החולים מתגלים בשלבים מאוחרים של המחלה כאשר היא מפושטת, ובשלב IV השרידות מדרדרת ל 00%. 04, אם כן, נראה כי לאור הפרוגנוזה הגרועה ואפשרויות הטיפול המוגבלות בסרטן ריאות מסוג NSCLC גישות תרפויטיות חדשניות דרושות להשלמת ארגז הכלים הטיפוליים מקור פוטנציאלי לגישות חדשניות יכול לצמוח מהתבוננות עמוקה אל תוך המנגנון אשר שולט בפתוגנזה של סרטן ריאות והתקדמות המחלה. 01 אחד הנושאים המרכזיים אותו יש לבחון, הינו כיצד גידול סרטן ריאות בשלביו 8

9 המוקדמים מתפשט אל עבר המיקרו סביבה של הריאה, וכן כיצד גידולי ריאה ראשוניים שולחים גרורות אל עבר איברים שניוניים כמו הריאה הקונטרה לטרלית, הכבד, העצמות והמח. 60 באופן יותר ספציפי, ישנה חשיבות גדולה הן בחקר האינטראקציה שבין תאי הגידול לבין המיקרו סביבה הטבעית של הריאה, והן בבחינה מעמיקה של התהליכים המעורבים בבקרה של גדילה והתפשטות הגידול. 60 אולם, המחקר אודות נושאים קריטיים אלו מעוכב בחלקו ע"י העדר מודל מתאים בחיות אשר מחקה באופן מדויק את ההתנהגות הקלינית של סרטן ריאות הומני בשלביו המוקדמים. כלומר, יצירת קשרית ריאתית בודדת אשר גדלה עם הזמן ושולחת גרורות קיימות שתי גישות עיקריות המשמשות לחקר היווצרות והתקדמות סרטן ריאות. הראשונה, משתמשת בעכברים אשר עברו שינויים גנטיים הגורמים להתפתחות ספונטנית של גידולים בשתי הריאות. 64,62 שיטה זו מבוססת על טרנספורמציה של תאי אפיתל, הנגרמת ע"י שימוש באונקוגנים או קרצינוגנים בריאה. שיטה זו נועדה בעיקרה לבדוק את השלבים הראשוניים בהתפתחות סרטן ריאות - מודל של.Cancer initiation מחד, מחקרים אשר בוצעו בשיטה זו הביאו להתקדמות משמעותית בהבנת התהליכים המעורבים ביצירת סרטן ריאות. מאידך, גישה זו טומנת בחובה השפעה על כלל המיקרו סביבה, ולכן עשויה להשפיע על מגוון רחב של גורמים ולהקשות על חקר מסלולים ספציפיים. הגבלות נוספות של מודל זה, קשורות ברמת המורכבות הגבוהה יחסית של מערכת המודל ומשך הזמן הממושך הדרוש עד להיווצרות גידולים. 60,60 הגישה השנייה, משתמשת במודל של השתלה אקטופית של תאים סרטניים. גם גישה זו טומנת בחובה הגבלות שונות: לדוגמא, מודלים בגישה זו מבוססים על הזרקת כמות גדולה של תאים סרטניים לווריד הזנב של העכבר. תאים אלו מתפשטים לכלל הגוף ובתוך זאת לריאה עצמה. מחד, מודל זה מאפשר ללמוד רבות על תהליכים של יצירת גורות בתוך הריאה מודל של.Metastasis התאים מצליחים ליצור גידולים מרובים בשתי הריאות, 66,64,61 אך מאחר ונוצרת מספר רב של גורות בעקבות הזרקת מספר רב של תאים, תיתכן השפעה משנית ניכרת של מערכת החיסון והמיקרו סביבה. כמו כן, כמות כה רבה של תאים אקטופיים אף עלולה לגרום לתגובה דלקתית מהירה ורחבת היקף. תגובה מסוג זה, עלולה למסך את האירועים הפיזיולוגיים המעורבים בשלבים המוקדמים בהיווצרות גידול. 40 אם כך, נראה כי מודל זה יכול להועיל רבות בחקר יצירת גרורות, אך אינו יכול לשמש למטרות חקירת היווצרות גידול ראשוני בריאה. 66,64,61 9

10 נושא חשוב נוסף אותו יש לקחת בחשבון, הוא התייחסות למיקום בו ההזרקה מבוצעת. ראיה לכך, נוכל לראות במודל בו מוזרקים תאים סרטניים מתחת לעור.)subcutaneous( אמנם, במודל זה מתפתחים 40 מתחת לעור גידולים מסוג סרטן ריאות, אך תאים סרטניים אקטופיים אלו נחשפים למיקרו- סביבה השונה לחלוטין מזו המקורית של הריאה, ועל כן עלולים לפעול במנגנונים ביולוגים שונים. על אף כי שתי גישות אלו, אשר תוארו לעיל, מספקות הצצה אל המנגנון המולקולרי העומד מאחורי היווצרות המחלה. ולמרות שגישות אלו מצליחות במידה מסוימת לדמות את תהליך היווצרות הגרורות בריאות )ע"י שימוש בתאים ממאירים לא מסוג סרטן ריאות(, הן אינן מצליחות לדמות את מהלך המחלה כפי הנצפה בבני אדם, דהיינו התפשטות של קשרית ריאתית בודדה בתוך המיקרו סביבה השלמה של הריאה בעבודה זו אתייחס למגבלות הקיימות במודלים הנוכחיים אשר הוצגו לעיל, ואנסה לתת מענה בצורה של מודל אורטוטופית )orthotopic( חדשני ועדין בחיות מעבדה, הכולל השתלה של תאי סרטן ריאות בגישה ייחודית באמצעות הזרקה מכוונות אל רקמת המטרה injection(.)sterotactic-guided בשונה משיטות קודמות, בעבודה זו אזריק כמות מצומצמת של תאים סרטניים בנפח מזערי ישירות לרקמת הריאה השמאלית של עכבר. המטרה היא ששימוש בטכניקה ממוקדת זו תאפשר יצירה מוצלחת של קשרית ריאתית מיקרוסקופית בודדה, המוקפת בפרנכימה תקינה בעלת מעורבות מזערית ככל הניתן של מערכת החיסון. לפיכך, נראה כי מודל זה יאפשר לבחון תהליכים מסוג.Cancer progression מודל זה יוביל לתרומה משמעותית בהבנת המנגנונים מאחורי היווצרות ראשונית של סרטן ריאות. כמו כן, מודל זה יכול לשרת כפלטפורמה אטרקטיבית בחקר הקשרים בין תאי גידול והמיקרו-סביבה של הריאה. 11

11 מטרות העבודה מטרת עבודה זו היא ליצור לראשונה מודל בחיה בו תיווצר קשרית ריאתית בודדה של סרטן ריאות המוקפת בפרנכימה תקינה. קשרית זו תגדל באופן מקומי ותתפשט לאורך זמן מעקב של בין 0-4 שבועות וע"י כך תאפשר לבחון שליחת גרורות אל איבר שניוני כמו הריאה הקונטרלטרלית או הכבד. יצירת הקשרית תתבצע תוך שימוש בטכניקה חדשנית ועדינה הכוללת הזרקה ממוקדת ישירות לרקמת הריאה. הזרקה זו תכלול שימוש במספר קטן מאוד של תאים ממאירים ובנפח הזרקה מזערי. פיתוח המודל החדשני הנ"ל יאפשר לחקות באופן קרוב את התפתחות והתקדמות סרטן הריאות כפי שהמחלה מתקדמת בבני אדם בשלביה המוקדמים. דבר זה יוכל לסייע בהמשך בהבנה מעמיקה של הקשרים בין תאי הגידול למיקרו סביבה של הריאה, ובכך להוביל למציאת מטרות תרפויטיות פוטנציאליות חדשניות בטיפול בגדילה והתפשטות סרטן ריאות. 11

12 חומרים ושיטות הרציונל מאחורי בחירת שורות התאים וסוגי העכברים הוחלט לבחון את המודל בעזרת שימוש בשתי שורות תאים, ושני סוגי עכברים כדלקמן: במערכת אלוגנאית,)alogeneic( הוזרקו תאים מסוג H460 )תאי סרטן ריאות הומאני( לעכברים מסוג NSG מדוכאי מערכת חיסונית )06 עכברים סה"כ(. גישה זו תאפשר לאפיין את דפוסי הגדילה וההתפשטות של התאים הממאירים ההומאניים אשר הוזרקו לריאות העכברים. במערכת סינגנאית,)syngeneic( הוזרקו תאים מסוג 3LL )תאי סרטן קרצינומת הריאה ע"ש לואיס( לעכברים מסוג C57BL/6 בעלי מערכת חיסון תקינה )44 עכברים סה"כ(. במקרה זה, הגידול יתפתח במיקרו-סביבה תקינה של מערכת החיסון ובכך יעזור באפיון עתידי של התגובה החיסונית הקשורה לגידול. שורות התאים H460 שורת תאי סרטן ריאות cancer( )Non-Small cell lung ממקור הומני. 4LL שורת תאי סרטן ריאות ממקור עכברי )הידועים כתאי סרטן ריאות ע"ש לואיס(. שתי שורות התאים נרכשו מATCC, ונשמרו בRPMI )Gibco Laboratories, Grand island,ny( המכיל: 0.01 mg/ml,100 U/ml penicillin, 1 mm L-glutamine, 00% של (FCS) feral calf serum Israel).streptomycin (Biological industries, Kibbutz Beth Haemek, כמו כן, כל שורות התאים נבדקו לזיהום ע"י מיקופלזמה, אשר נמצא שלילי. תכנון וכיול המודל In Vivo 06 עכברים מסוג NSG מדוכאי מערכת חיסון, עבור כיול המערכת האלוגנאית,)Allogeneic( נלקחו אשר עברו הזרקה של תאים מסוג H460 )תאי סרטן ריאות הומני( ישירות לפרנכימת הריאה בכמויות תאים של 3^10*7.5 ו 4^10 בהתאמה )2 עכברים לקבוצה(. העכברים הוקרבו לאחר 4 שבועות על מנת להעריך את היווצרות הגידול )טבלה 0(. 12

13 C57BL/6 04 למטרות כיול הניסוי במערכת הסינגנאית,)Syngeneic( נלקחו עכברים מסוג בעלי מערכת חיסון תקינה, אשר עברו הזרקה של תאי 3LL ישירות לפרנכימת הריאה בכמויות תאים של 640,400,000 בהתאמה )5 עכברים לקבוצה(. העכברים הוקרבו לאחר 4 שבועות על מנת להעריך את היווצרות הגידול )טבלה 0(. על מנת להעריך את הגידול ע"י,PET/CT הוזרקו 400 תאי 3LL ישירות לפרנכימת הריאה של 4 עכברי.C57BL/6 הדמיות בוצעו לאחר 4 שבועות מההזרקה. על מנת לבחון את היסטולוגיית הגידול שבוע לאחר ההזרקה, הוחלט להזריק 400 תאי 3LL לפרנכימת הריאה של 4 עכברי,C57BL/6 אשר הוקרבו בהתאם. ישירות 3LL עבור הצביעות האימנו-פלורוסנטיות, הוזרקו 400 תאי המסומנים בGFP ל 00 עכברים מסוג 4( העכברים הוקרבו לאחר שבוע ולאחר 4 שבועות ממועד ההזרקה בהתאמה עכברים.C57BL/6 לקבוצה(. פירוט הפרוצדורה הניתוחית וטכניקת ההזרקה תאים מסוג H460 בכמות של 3^10*7.5 או 4^10 פר 0 מיקרו-ליטר )ul( ותאים מסוג 3LL בכמויות של BD ( RMPI-1640 פר 0 מיקרו-ליטר,(uL) נקצרו מתוך תרביות והורחפו בתוך 640,400,0000.)bioscience טרם ההזרקה, התאים עורבבו עם מטריג'ל Bioscience( )BD ביחס של 0:0 ונשמרו על קרח עד להזרקה. לאחר מכן, התערובת הועברה לתוך מזרק בעל נפח של 00 מיקרו-ליטר )ul( Hamilton, NV, ( ) אשר הותאמה לו מחט של 40G. המזרק הולבש על מערכת ההזרקה הסטריאוטקטית )תמונה 0( USA שהוכנה מראש לניתוח, ו 6 מיקרו-ליטר )ul( של התערבות עם התאים הוזרקו לכל עכבר. העכברים הורדמו הרדמה עמוקה על ידי הזרקה לחלל הצפק peritoneal( )intra של התערובת Ketamine Ketamine במינון שנקבע על פי הנחיות וועדת האתיקה המקומית. ריכוזי התמיסות: \Xylazine הכנת התערובת: מ"ל קסילזין קטמין מ"ל מ"ל. Xylazine 20mg\ml,100mg\ml לעכברים בין הוזרקו משקל לפי מ"ל )בין העכבר בוצע ווידוא גרם(. מצב הרדמה.PBS עמוקה על ידי העדר רפלקס לאחר צביטה בכף הרגל ו/או בקצה הזנב. לאחר מכן, הפרווה המכסה את בית 13

14 החזה השמאלי גולחה. בשלב הבא, העכברים הושכבו על צדם הימני ובוצע חתך קטן )0.4 - ס 0 "מ( בעורם מתחת לעצם השכם )scapula( השמאלית. בהמשך, שרירי בית החזה הופרדו בעדינות עד לחשיפת המרווח הבין צלעי הפנימי והפלאורה של הריאה. לאחר מכן, נספרו הצלעות מהגבול התחתון של כלוב הצלעות ומעלה, ומיקום ההזרקה בוצע בין הצלע הרביעית לחמישית בקו האקסילרי האחורי. בשלב זה, הקצה של המזרק הונח בעדינות על המרווח הבין צלעי הפנימי. המחט הוחדרה לעומק של 4.4 מ"מ לתוך פרנכימת הריאה והוזרקה התערובת עם תאי הגידול. בסיום ההזרקה, נשלף המזרק מן הרקמה, הוחזרו השרירים המכסים את בית החזה למקומם והעור נתפר חזרה. בסיום התהליך העכברים קיבלו תרופות אנלגטיות, והועברו להתאוששות למשך דקות באינקובטור אשר חומם מראש. קצירת הריאה נעשה בצורה הבאה: ראשית, העכברים הוקרבו ע"י מנת יתר של זריקת קטמין\קסילזין. לאחר מכן, נחשף חלל בית החזה והריאות עברו פרפוזיה עם בופר של 3% פארא-פורמלדהיד דרך הטרכיאה. למטרות ביופסיה בחתך קפוא section(,)frozen הריאות עברו פרפוזיה עם בופר של 6% פארא-פורמלדהיד דרך הטרכיאה, והוקפאו בOCT (. frozen tissue matrix( פרוטוקול הניסוי אשר בוצע במחקר זה, אושר ע"י הועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים בבית החולים האוניברסיטאי הדסה. הדמיית מיקרו PET/CT F-FDG כשעה טרם ביצוע הדמיית המיקרו CT\PET, הוזרק סוכר רדיואקטיבי מסוג במינון של,uCI ישירות לתוך וריד הזנב של 4 עכברי c57bl\6 בעלי גידול בן 4 שבועות. לאחר מכן בוצעה ההדמיה. כל המדידות נעשו בעזרת Inveon multimodality PET-CT small animal-dedicated scanner attenuation, inc.).(siemens Medical Solutions, USA כל הנתונים עברו נורמליזציה ותיקון ע"פ :. בניית תמונת ההדמיה בוצעה ע"י:- two Fourier rebinning randoms, dead time, decay (2D-OSEM).dimensional orderd-subsets expectation maximization בגודל ווקסלי של 0.776*0.776*0.796 מ"מ^ 4. ניתוח ההדמיות בוצע ע"י Inveon Research Workplace 3.1 (Siemens. ) Medical Solution, USA inc. ההדמיה בוצעה בשיתוף עם ד"ר עידו וייס מהמעבדה לתרפיה גנטית ובעזרת יחידת הציקלוטרון בביה"ח הדסה עין כרם. 14

15 צביעות היסטולוגיות H&E ואימונו-פלורסטיות דגימות רקמות נלקחו הן מריאות המשמשות כקונטרול, והן מריאות בעלות גידול. הדגימות קובעו בפורמלין והושקעו בפאראפין. לאחר מכן, בוצע חיתוך סיריאלי section( )serial במרווחים של 4-7, um אשר הועברו לזכוכיות למטרת צביעת.H&E מסוג תאים אשר מבטאים )Green fluorescent protein נוצרו מבעוד מועד במעבדה. ( GFP 3LL עבור הצביעות האימונו- פלורסנטיות,)GFP( שימשו הנוגדנים הבאים: GFP was amplified by chicken polyclonal antibodies to GFP (Abcam, ab13970), followed by Alexa 488 donkey anti chicken secondary antibodies (Jackson ). תמונה 1 תמונה 1: אילוסטרציה של מערכת הניסוי הסטריאוטקטית. 15

16 תוצאות הזרקה אינטרה- פרנכימלית של כמות תאים מזערית מסוג סרטן ריאות עכברי,)3LL( יצרה בהצלחה קשרית ריאתית בודדה הניתנת לגילוי באמצעות.PET\CT מטרת סדרת הניסויים הראשונה, הייתה ליצור קשרית ריאתית בודדה ע"י הזרקת כמות מזערית של תאי סרטן ריאות עכברי )3LL( ישירות לפרנכימה של הריאה השמאלית של עכבר. ההסבר מאחורי בחירת הריאה השמאלית, נובע מהסיבה שבגזע זה של מכרסמים, ריאה זו מכילה אונה אחת בלבד. לכן, עובדה זו תבטיח את הדיוק בהזרקת התאים הממאירים לתוך מתחם אנטומי ברור )תמונה 6 א(. בנוסף, בניסיון להפחית כל נזק נוסף לרקמה ועל מנת למנוע פיזור של תאים מהריאה לחלל בית החזה, הוחלט על שימוש במזרק עדין ביותר ועל הרחפת התאים במטריג'ל בנפח הזרקה סופי של 2uL )מיקרו ליטר(. נפח זעיר זה מייצג כ 0.4% מכלל נפח הריאה השמאלית של עכבר. על מנת לכייל את המודל ולבחון את קצב יצירת הגידולים, הוחלט על הזרקת מינונים של 400,640 ו 0000 תאי סרטן ריאות עכברי מסוג 3LL אל תוך הריאה השמאלית של 04 עכברים מסוג C57BL/6 )4 עכברים בכל קבוצת תאים(. החיות הוקרבו לאחר 4 שבועות ממועד ההזרקה. לאחר ההקרבה ניתן היה להבחין בקשרית בצורה מקרוסרופית. בנוסף, נראה כי הודות לשימוש בטכניקה העדינה ונפח הזרקה מזערי, העכברים פיתחו קשרית ריאתית בודדה, אשר לא לוותה בגידולים נוספים בבית החזה )תמונה 6 ב(. קשריות ריאתיות נוצרו ב( 3/5 ) 60% מתוך העכברים אשר עברו הזרקה של 640 תאים, ב (4/5) 80% מתוך העכברים אשר עברו הזרקה של 400 תאים וב (5/5) 100% מתוך העכברים אשר עברו הזרקה של 0000 תאים )טבלה 0(. בהמשך, 4 עכברים מורדמים שעברו הזרקה של 400 תאי 3LL ישירת לפרנכימת הריאה השמאלית, נבדקו באמצעות הדמיית micro-pet/ct על מנת לזהות את הקשרית הריאתית. כפי המצופה, וכפי הניתן לראות בתמונה 4 א-ג, הן הPET והן הCT יחדיו הדגימו באופן ברור את אופייה המבודד של הקשרית הריאתית בריאה השמאלית. הווה אומר הגידול אכן ממוקם לוקלית באתר ספיציפי. 16

17 תמונה 2 תמונה 2: א( אילוסטרציה אנטומית של ריאת מכרסם )עכבר(. ניתן להבחין בקיומה של אונה שמאלית יחידה. הקו השחור מייצג את פלאורת הריאה. החץ השחור והעיגול האדום מייצגים הזרקה טרנס-פלאורלית של תאי גידול לתוך פרנכימת הריאה השמאלית. ב( תמונת חזה מייצגת של עכבר מסוג C57BL/6 אשר הוקרב לאחר 4 שבועות ממועד הזרקת 400 תאי 3LL )תאי קרצינומת הריאה ע"ש לואיס( ישירות לריאה שמאל. החץ השחור מצביע על קשרית מקרוסקופית בודדה בריאה השמאלית. LL - ריאה שמאל, -PCL אונה ימנית אחורית. 17

18 טבלה 1 טבלה 1: טבלה זו מתארת את אחוזי הצלחת יצירת גידול בודד בעכברים מסוג c57bl\6 ו,NSG בשימוש בתאי 3LL ו H460 בהתאמה. תמונה 3 תמונה 2: א-ג( הדמיה מייצגת באמצעות PET/CT של עכברים מסוג C57BL/6 אשר הוקרבו לאחר 4 שבועות ממועד הזרקת תאי 3LL ישירות לריאה השמאלית. א( חתכים בCT. ב( חתכים בPET. ג( שילוב של.PET/CT שורה עליונה מראה חתכים אקסיאלים. שורה תחתונה מראה חתכים קורונלים. ראשי חצים מצביעים על הגידול. חצים מצביעים על הלב. 18

19 השתלה אורטוטופית של תאי 3LL מדגימה תבנית גדילה אגרסיבית, המחקה סרטן ריאות הומני מסוג. NSCLC STAGE I בסדרת הניסויים השנייה של המחקר, הוחלט לבחון את תכונותיו המיקרוסקופיות של הגידול בדגש על פרמטרים של קצב גדילה ויכולת פולשנות מקומית. למטרות אלו, הוכנו סדרות של חתכים היסטלוגים מריאות של 00 עכברים אשר הוזרקו לתוכן 400 תאי. 3LL העכברים הוקרבו לאחר שבוע ולאחר 4 שבועות ממועד ההזרקה )4 עכברים לקבוצה בהתאמה(. בבדיקה מיקרוסקופית של תתקינים שנלקחו מריאות עכברים אשר הוקרבו לאחר שבוע, ניתן היה להבחין בהיווצרות של גידול קטן מבודד המוקף בפרנכימת ריאה תקינה )תמונה 3 ב(. לא נצפתה תגובה דלקתית משמעותית בתוך הגידול ובסביבתו. באופן דומה, היה ניתן להבחין בהיווצרות גידול בודד בבדיקה 4 מיקרוסקופית של תתקינים שנלקחו מריאות עכברים אשר הוקרבו לאחר שבועות. במקרה זה, כפי הצפוי בנקודות זמן זו, הגידול היה משמעותית גדול יותר )תמונה 3 ג(. בהתמקדות על אזור הממשק שבין פרנכימת הריאה לבין הגידול בן ה 4 שבועות, נמצא שתאי הגידול מסוג 3LL פלשו לעבר נאדיות ריאה )אלבאולי( שכנות והקיפו מבנים וסקולרים ריאתיים )תמונה 3 ד(. בנוסף, ניתן היה להבחין בהצטברות משמעותית של תאי מערכת החיסון אשר הסתננו לאזור שבין הגידול לפרנכימת הריאה )תמונה 3 ד(. על מנת לתקף את הטכניקה הניתוחית ולאשר שאכן נוצר גידול בודד בעל אזור מיקוד יחיד, 400 תאי גידול מסוג 3LL אשר הודבקו מבעוד מועד במעבדה בפלסמיד המבטא,GFP הוזרקו ל 00 עכברים מסוג.C57bl\6 4 ואכן, בדיקות מיקרוסקופיות פלורסנטיות של הריאה השמאלית לאחר שבוע ולאחר שבועות ממועד הזרקת התאים, הראו כי נוצר גידול בודד בריאה השמאלית )תמונה 4 א,ב(. באופן הראוי לציון, לא ניתן היה להבחין בתאי GFP חיוביים באזורים המרוחקים ממקום יצירת הגידול הראשוני )תמונה 4 א,ב(, או באונות מרוחקות )מידע לא מצורף(. דבר זה מצביע על כך שאף לא תא בודד ניתק מהגידול המקורי. 19

20 א: אם כן, תצפיות הניסויים המפורטות לעיל מאשרות את אופיו המבודד של מודל אורטוטופי זה, ומדגימות את העובדה שבתאי גידול מסוג 3LL קיימת יכולת פולשנות מקומית המחקה את היכולת הפולשנית של סרטן ריאות הומני מסוג.NSCLC stage I תמונה 4 -ד( תמונה 4 חתכים היסטולוגים מייצגים מריאות של עכברים מסוג C57BL/6 אשר הוקרבו לאחר שבוע ו 4 שבועות ממועד הזרקת תאי 3LL לריאה השמאלית. א( ריאה תקינה המשתמש כקונטרול, הגדלה X00. ב( גידול בן שבוע, הגדלה X00. ג( גידול בן 4 שבועות, הגדלה X3. ד( גידול בן 4 שבועות: ראשי חץ אדומים מצביעים על תאי גידול הפולשים למרווח האלבאולרי, ראשי חץ שחורים מצביעים על תאי מערכת החיסון המקיפים כלי דם גדול )חץ לבן( בפריפריה של הגידול. ניתן לראות גם כי תאי הגידול מתחילים להקיף את הכלי. ראשי חץ לבן מצביעים על כלי דם קטנים )מיקרו( בתוך הגידול, הגדלה X60. 21

21 א. תמונה א 5 תמונה 5 א,ב: צביעה אימונו-פלורסנטית של חתכים היסטולוגיים מרקמת ריאה של עכברים מסוג c57bl/6 אשר הוקרבו לאחר שבוע ו 4 שבועות ממועד הזרקה של 400 תאים מסוג 3LL המבטאים.GFP ירוק: צביעת אנטי-,GFP כחול: צביעה נוקלארית מסוג Bar= 100uM,Hoechst ) צביעת אנטי GFP של ריאה שמאל שבוע ימים לאחר הזרקת התאים, ניתן לראות את התאים הגידוליים המסומנים בירוק. ב( צביעת אנטי GFP של ריאה שמאל 4 שבועות לאחר הזרקת התאים, ניתן לראות את התאים הגידוליים המסומנים בירוק. השתלת תאי סרטן ריאות הומני )H460( בעכברים מדוכאי מערכת חיסונית,)NSG( מדגימה את היווצרותה של קשרית ריאתית בודדה אשר עם הזמן גדלה מקומית ושולחת גרורות. בחלקו האחרון של מחקר זה, הוחלט לבחון את יכולת היווצרות גרורות במודל זה. עבור מטרה זו, נעשה שימוש במודל האורטוטופי להזרקת כמות מזערית של תאי סרטן ריאות הומני )H460( לעכברים מדוכאי מערכת חיסונית )עכברי.)NSG מחקרים קודמים אשר השתמשו במודל אורטוטופי עבור השתלת תאי NSCLC הומניים, דיווחו על שימוש בכמות גדולה מאוד של תאים בעת ההזרקה ( 7^6-10^10 ), דבר זה עלול לגרום לפיזור תאים בחלל בית החזה ולהוביל לבעיה ביצרית גבולות אנטומיים ברורים. על מנת לעקוף מגבלות אלו, הוחלט להגביל את כמות התאים המוזרקים ללא יותר מ 4^10*1 תאי קרצינומת 21

22 סרטן ריאה הומני מסוג H שבועות לאחר מועד ההזרקה, העכברים הוקרבו ונמצא כי נוצרו גידולים ב )6\5( עכברים אשר עברו את תהליך ההזרקה, כלומר 04% הצלחה. )טבלה 0(. יתרה מזאת, כאשר נלקחו דגימות היסטולוגיות מהריאה הקונטרה-לטרלית והכבד של עכברים בעלי גידול, נמצא כי )4/6( 22% מהעכברים פיתחו גרורות לריאות )תמונה 2 ב( ו 44% )2/6( פיתחו גרורות לכבד )תמונה 2 ג(. תמונה 6 תמונה 1 א-ג: חתכים הסיטולוגים מייצגים מריאות וכבד של עכברי,NSG אשר הוקרבו 4 שבועות לאחר הזרקה של תאי H460 ישירות לריאה השמאלית. א( גידול של תאי H460 בריאה השמאלית הגדלה )X4(. ב( מיקרו גרורה של תאי H460 בריאה הקונטרה לטרלית הגדלה )X10(. ג( גרורה של תאי H460 בכבד הגדלה )X10(. 22

23 דיון סרטן הריאות הינה אחת ממחלות הסרטן הקשות והקטלניות ביותר ושכיחותה עולה עם השנים. 0 אחת הסיבות העיקריות להיותה גורם המוות מספר אחת מבין מחלות הסרטן היא הקושי באבחון המחלה בשלביה הראשונים. כיוון שברוב המקרים המחלה מתגלה בשלביה המאוחרים, יכולת הטיפול בה מוגבלת. 4 כיום, הודות לשיפור ההולך וגובר בבדיקות הסקר, מספר החולים המאובחנים בסרטן ריאה בשלביו הראשונים צפוי לגדול בצורה משמעותית מגמה זו מדגישה את הצורך הגובר בפיתוח מערכת מודל מתאימה בסרטן ריאות בשלביו הראשונים. מערכת מסוג זו תאפשר לחוקרים להתחקות אחר הדינמיקה מאחורי תהליך הגדילה וההתפשטות של הסרטן, בתוך המיקרו-סביבה של הריאה ומתוכה החוצה. בנוסף, מערכת זו תסייע בגילויים עתידיים של מנגנונים מולקולריים קרדינליים השולטים בהתקדמות המחלה עבודה זו מציגה מודל חדשני לסרטן ריאות המבוסס על טכניקה עדינה ומדויקת של השתלת כמות תאים זעירה הן של סרטן ריאות הומני )H460( והן של סרטן ריאות עכברי,)3LL( ישירות לפרנכימת הריאה. טכניקה זו אפשרה לחקות באופן קרוב ביותר, במודל מן החי vivo(,)in את רצף האירועים הקליניים המאפיינים את התקדמות סרטן הריאות מסוג NSCLC בשלביו הראשונים. שיטת השתלה ממוקדת זו אפשר יצירה מוצלחת של קשרית ריאתית מיקרוסקופית בודדה המוקפת בפרנכימית ריאה תקינה. במשך זמן מעקב של 0-4 שבועות, קשרית זו גדלה מקומית והתפשטה אל עבר מבנים סמוכים ואיברים מרוחקים )גרורות(, בצורה האופיינית לסרטן ריאות מסוג.NSCLC מספר עבודות מחקר קודמות בתחום ניסו ליצור מודל מתאים של סרטן ריאות ע"י הזרקה ישירה של תאים ממאירים )הומניים ועכבריים( לפרנכימת הריאה מודלים ראשוניים אלו סיפקו ממצאים חשובים המדגישים את הצורך בפיתוח מודל מתאים המחקה את התפתחות המחלה בסביבתה הטבעית. 63,41 אולם, טכניקות העבודה אשר דווחו בעבודות אלו סבלו ממספר מגבלות אשר מנעו את הצלחתו של בניית מודל מתאים המחקה סרטן ריאות בשלביו הראשונים. לדוגמא, עבודות קודמות אלו מדווחות על שימוש במחטים גדולות ובמספר אשר הורחפו תאים של רב ההזרקה בנפח בעת גדול יחסית )לדוגמא 6^10*0 תאים בנפח )20uL כתוצאה מכך, טכניקה זו הובילה להתפשטות מוקדמת של תאי גידול מן הריאה לבית החזה, אינה אשר בצורה את תואמת התהליך הפתולוגי סרטן של ריאות הומני בשלביו 23

24 הראשונים. בנוסף, שימוש תאים של גדולה כה בכמות הובילה לשליחת עבר אל הגידול ע י גרורות קשריות לימפה אקסילריות, דבר אשר אינו נחשב כאתר ראשוני של סרטן ריאות בשלבים ראשוניים. 44,41 מגבלות נוספות הורגשו במיוחד בעת ניסיון לחזור על הטכניקות אשר פורסמו במאמרים קודמים. השימוש במחטים גדולות ונפח הזרקה גדול הוביל לנזק רקמתי נרחב. כמו כן, אי שימוש בהנחיה סטריאוטקטית guidance( )streoractic הוביל לקושי בהבטחת מיקום ההזרקה המדויק ועומק החדירה. הטכניקה המוצעת בעבודה זו, מתגברת על המגבלות הקריטיות אשר בלטו בעבודות קודמות באמצעות שימוש במזרקים קטנים במיוחד, כמות תאים קטנה יותר ונפח הזרקה מצומצם )400 תאים ל 6 מיקרו- ליטר(. בנוסף, החדרת התאים תחת ההנחיה של מערכת ההזרקה הסטריאוטקטית, מבטיחה את עומק ההזרקה והמיקום בצורה מדויקת יותר. יתרון נוסף של מערכת הזרקה זו, הוא מניעת ההתפשטות המוקדמת של התאים הסרטניים לעבר דופן בית החזה ולקשריות לימפה חיצוניות כמו קשריות אקסילריות, אשר לרוב לא מערובות בשלבים ראשונים של סרטן ריאות מסוג. 4 NSCLC על מנת להדגים את האופי האנטומי המבודד של טכניקת ההזרקה, בוצע שימוש בתאים המבטאים.GFP שימוש זה הדגים כי לאחר הזרקת התאים, נוצר מוקד גידול בודד וששום תא סרטני בודד לא נמצא דיסטלית למקום ההזרקה. יתרה מזאת, ובניגוד לעבודות קודמות, הניתוח ההיסטולוגי של רקמת הריאה שבוע לאחר הזרקת התאים לא הדגים מעורבות של תאים סרטניים בפרנכימת הריאה המקיפה את הגידול. כמובן שיש לציין כי גם במודל זה קיימות מספר מגבלות פנימיות. מגבלות אלו, נובעות משימוש במערכת מודל הכוללת עכברים מדוכאי חיסון )NSG( ושורת תאים הומניים )H460(. מאפיינים אלו, עשויים להשפיע על קצב התפתחות הגידול, ויכולים להשתנות במידה ניכרת בין סוגים שונים של תאים ומצבם של העכברים )מצב אימונולוגי, גזע, גיל(. 24

25 סיכום עבודה זו מציגה מודל אורטוטופי חדשני לסרטן ריאות המבוסס על טכניקה עדינה ומדויקת של השתלת כמות תאים זעירה, הן של סרטן ריאות הומני והן של סרטן ריאות עכברי ישירות לפרנכימת הריאה. מודל זה מחקה באופן מדויק את רצף האירועים הקליניים המאפיינים את התקדמות מחלת סרטן הריאות מסוג NSCLC בשלביה הראשונים. שיטת השתלה ממוקדת זו אפשרה יצירה מוצלחת של קשרית ריאתית מיקרוסקופית בודדה המוקפת בפרנכימית ריאה תקינה. במשך זמן מעקב של 0-4 שבועות, קשרית זו גדלה מקומית והתפשטה אל עבר מבנים סמוכים ואיברים מרוחקים )גרורות(, בצורה האופיינית לסרטן ריאות מסוג.NSCLC בתוך כך, נראה כי מערכת מודל זו מייצגת פלטפורמה אטרקטיבית לניתוח מנגנוני מפתח מולקולריים האחראים על התפתחות המחלה וזיהוי מטרות תרפויטיות פוטנציאליות. 25

26 Summary This novel orthotopic lung-cancer model that is characterized by refined delivery of tumor cells directly into the lung parenchyma, closely mimics the clinical sequence of events that characterize the propagation of early stage human non-small cell lung cancer. Specifically, the experimental methodology successfully induces a solitary microscopic pulmonary nodule that is surrounded by normal lung parenchyma and that during a follow-up period of 1-5 weeks locally grows and distally spreads. This model can further facilitates the genomic and immunologic analysis of the interactions between tumor cells and the tumor microenvironment, thereby shedding light on potential therapeutic targets. More broadly, this work emphasizes the importance of moving towards modeling of malignant diseases in a manner that closely resembles clinical disease characteristics both in regards of primary anatomic location and in regards of secondary sites of spread and metastasis. Indeed, through the accurate portrayal of disease progression a successful hunt for therapeutic targets may commence. 26

27 רשימת ספרות 1. Siegel R, Naishadham D, Jemal A. Cancer statistics, CA Cancer J Clin2012 Jan- Feb;62(1): The World Health Organization, Cancer, Fact sheet N297, accessed June 15, 2014, 3. Detterbeck FC, Boffa DJ, Tanoue LT. The new lung cancer staging system. Chest 2009 Jul;136(1): Jennifer S. Temel et al. (May 2010) Early Palliative care for patients with metastatic nonsmall-cell lung cancer. The New England Journal of Medicine PMID Tai-An Chiang et al. (November 2008) Important prognostic factors for the long-term survival of lung cancer subjects in Taiwan. Biomed Central. 6. Corner et al. (April 2005) Is late diagnosis of lung cancer inevitable? Interview study of patients recollections of symptoms before diagnosis. Thorax PMID: Thun, MJ; Hanna LM, Adams-Campbell LL et al. (2008). Lung cancer occuraence in never-smokers: An Analysis of 13 Cohorts and 22 Cancer Registry Studies. PLos Medicine 5 (9): e The World Health Organization, Tabacco, Fact sheet N339, accessed June 15, 2014, 9. Li X, Hemminiki K. Inherited predisposition to early onset lung cancer according to histological type. Int J cancer 2004; 112(3): Pubmed: Julian R. Molina et al. (May 2008) Non small lung cancer: Epidemiology, Risk Factorsm Treatment and Survivorship. Mayo Clin Proc.PMID: Subramanian J et al. (Feb 2007) Lung cancer in never somikers: a review, J. Clin Oncol PMID: S. Tsim et al (December 2010) Staging of non-small cell lung cancer (NSCLC) a review. Respiratory Medicine PMID: Spiro. S. G, and G.A. Silvestri One hundred years of lung cancer. Am J Respir Crit Care Med 172: Goldstraw P, Crowley J Chansky K, et al. The IASLC lung cancer staginh project: proposals fot the revision of thr TNM classification of malignany tumors. K Thorac oncol 2007; 2: Mountain CF (jun 1997) Revisions in thr international System for Staging lung cancer. Chest online PMID: Wald O, Shapira OM, Izhar U. CXCR4/CXCL12 axis in non small cell lung cancer (NSCLC) pathologic roles and therapeutic potential. Theranostics2013;3(1): Saintigny P, Burger JA. Recent advances in non-small cell lung cancer biology and clinical management. Discov Med 2012 Apr;13(71): Burger JA, Stewart DJ, Wald O, Peled A. Potential of CXCR4 antagonists for the treatment of metastatic lung cancer. Expert Rev Anticancer Ther 2011 Apr;11(4): Hanahan D, Weinberg RA. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 2011;144: Chaffer CL, Weinberg RA. A perspective on cancer cell metastasis. Science. 2011;331:

28 21. Perlikos F, Harrington KJ, Syrigos KN. Key molecular mechanisms in lung cancer invasion and metastasis: A comprehensive review. Crit Rev Oncol Hematol Meuwissen R, Berns A. Mouse models for human lung cancer. Genes Dev. 2005;19: de Seranno S, Meuwissen R. Progress and applications of mouse models for human lung cancer. Eur Respir J. 2010;35: Graves EE, Vilalta M, Cecic IK, et al. Hypoxia in models of lung cancer: implications for targeted therapeutics. Clin Cancer Res. 2012;16: O'Hagan RC, Heyer J. KRAS Mouse Models: Modeling Cancer Harboring KRAS Mutations. Genes Cancer. 2011;2: DuPage M, Dooley AL, Jacks T. Conditional mouse lung cancer models using adenoviral or lentiviral delivery of Cre recombinase. Nat Protoc. 2009;4: Frese KK, Tuveson DA. Maximizing mouse cancer models. Nat Rev Cancer. 2007;7: Wakamatsu N, Devereux TR, Hong HH, Sills RC. Overview of the molecular carcinogenesis of mouse lung tumor models of human lung cancer. Toxicol Pathol. 2007;35: Fantozzi A, Christofori G. Mouse models of breast cancer metastasis. Breast Cancer Res. 2006;8: Khong HT, Restifo NP. Natural selection of tumor variants in the generation of "tumor escape" phenotypes. Nat Immunol. 2002;3: Pierra M, Yohann L. Bioluminescent Orthotopic Mouse Models of Human Localized Non-Small Cell Lung Cancer: Feasibility and Identification of Circulating Tumour Cells. PLos One. 2011; 6(10); e Jacobson FL, Austin JH, Field JK, et al. Development of The American Association for Thoracic Surgery guidelines for low-dose computed tomography scans to screen for lung cancer in North America: recommendations of The American Association for Thoracic Surgery Task Force for Lung Cancer Screening and Surveillance. J Thorac Cardiovasc Surg. 2012;144: Jacobson FL, Jaklitsch MT. Lung cancer screening trials: the United States and beyond. J Thorac Cardiovasc Surg. 2012;144: S Jaklitsch MT, Jacobson FL, Austin JH, et al. The American Association for Thoracic Surgery guidelines for lung cancer screening using low-dose computed tomography scans for lung cancer survivors and other high-risk groups. J Thorac Cardiovasc Surg. 2012;144: Liu X, Liu J, Guan Y, et al. Establishment of an orthotopic lung cancer model in nude mice and its evaluation by spiral CT. J Thorac Dis. 2012;4: Yamaura T, Doki Y, Murakami K, Saiki I. Model for mediastinal lymph node metastasis produced by orthotopic intrapulmonary implantation of lung cancer cells in mice. Hum Cell. 1999;12: Doki Y, Murakami K, Yamaura T, Sugiyama S, Misaki T, Saiki I. Mediastinal lymph node metastasis model by orthotopic intrapulmonary implantation of Lewis lung carcinoma cells in mice. Br J Cancer. 1999;79: Koizumi K, Kozawa Y, Ohashi Y, et al. CCL21 promotes the migration and adhesion of highly lymph node metastatic human non-small cell lung cancer Lu-99 in vitro. Oncol Rep. 2007;17: Onn A, Isobe T, Itasaka S, et al. Development of an orthotopic model to study the biology and therapy of primary human lung cancer in nude mice. Clin Cancer Res. 2003;9:

29 נספח Published papers: Weiss I, Ella E, Dominsky O,Wald o, et al. In the Hunt for Therapeutic Targest: Mimicking the Growth, Metastasis, and Stromal Association of Eraly-Stage Lung Cancer Using a Novel Orthotopic Animal Model. J Thorac oncol jan 2015; 10: